玉米基因组编辑团队在碱基编辑PAM拓展技术方面再获新进展

 碱基编辑技术(Base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因编辑技术，在2017年被Science杂志评为年度十大科学技术突破之一。由于单碱基基因编辑器不引入双链DNA断裂，被认为比传统方法更加高效而安全。SpCas9是目前最广泛的核酸酶，其技术参数也已被详细研究和报道。来源于金黄色葡萄球菌Cas9的变体SaKKH（识别NNNRRT PAM），可以识别SpCas9及其变体包括xCas9和Cas9-NG均不能识别的HHHAAT (H = A, T, or C) PAM。但到目前为止，无论是植物中还是动物中，SaKKH-CBEs的技术参数，包括碱基编辑窗口，编辑窗口内C两侧碱基的偏好性以及单位点碱基编辑效率最高的C所处靶点位置等都没有明确详尽的研究结果，因此，极大的限制了SaKKH-CBE的实际应用。

 近日，北京农林科学院玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室基因组编辑团队在The Crop Journal（IF=3.179，中科院Q1期刊）上发表题为“Highly efficient CRISPR-SaKKH tools for plant multiplexcytosine base editing”的研究论文，建立了基于金黄色葡萄球菌Cas9变体SaKKH实现多重靶点编辑的胞嘧啶碱基编辑器，明确了该碱基编辑器的多项技术参数，并通过改造SaKKH专用sgRNA骨架结构实现了该编辑器的效率增加。

 本研究首先建立了基于tRNA-sgRNA系统的多重靶点胞嘧啶碱基编辑器SaKKHn-pBE，结果表明其能够编辑含有NNARRT, NNCRRT, NNGRGT和 NNTRGT PAM的靶点。进一步，该研究通过综合分析27个有效编辑靶点的碱基突变情况，明确了SaKKHn-pBE的主要技术参数，例如，其碱基编辑窗口为靶点1-15bp，主要集中在4-9bp；SaKKHn-pBE编辑窗口内C两侧碱基的偏好性：5‘端偏好碱基为T和C（CC > TC >> GC > AC），3’端偏好碱基为G（CG>CA≈CC>CT）；尤其值得一提的是，SaKKHn-pBE碱基突变类型主要为单碱基突变，且绝大部分靶点内单位点碱基编辑效率最高的C都获得了单碱基突变体。最后，基于SaKKHn-pBE效率普遍偏低的情况，该研究还通过优化Sa-sgRNA的骨架结构进一步提高了SaKKHn-pBE碱基编辑效率。该项工作为SaKKHn-pBE工具应用于水稻基础研究或分子育种中奠定了基础，且可为其他植物或动物提供参考。这是玉米基因组编辑团队继之前利用SaCas9、xCas9和Cas9-NG进行基因编辑PAM拓展之后，进一步增加了基因组编辑技术应用范围，实现了行业领先的植物PAM识别谱，为在更广泛的植物基因组范围内进行基因组编辑提供了可能。

 张成伟为本文第一作者，杨进孝为本文通讯作者。本研究得到北京学者（BSP041）项目资助。玉米基因组编辑团队是2017年由玉米DNA指纹及分子育种重点实验室引进建设的技术创新团队，目前主要聚焦于碱基编辑、精确替换、组学编辑及其在玉米和水稻等作物中的高效应用。该团队自引进以来已在国际学术期刊上发表多篇高水平研究论文。

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